一、什么是免疫组化？

免疫组织化学又称免疫细胞化学是利用抗原与抗体间的特异结合原理和特殊的标记技术，对组织和细胞内特定抗原或抗体进行定位、定性或者定量检测的一项技术，借助光学显微镜可观察组织细胞内标记物显示出的特异性的抗原-抗体结合物，即阳性反应。

二、为什么要做免疫组化？

在常规病理诊断中，大概有10%～20%左右的肿瘤病例，很难根据形态做出明确的病理诊断，这时候就需要加做免疫组化检测，很多肿物在早期时，是通过厘米或毫米级的活检穿刺小标本发现，由于组织在穿刺过程中被物理挤压导致了细胞形态发生改变，病理诊断医师无法观察到完整的组织结构，这时候就需要通过免疫组化技术来帮忙解决。

有时同一种病变可以显示不同的形态，不同的病变也可以表现为相同或相似的形态，仅凭常规组织病理检查很难区别。免疫组化可以把不同来源的组织和细胞标记出来，从蛋白水平把它们区分开来，从而得出更准确的病理诊断，指导临床对患者进行治疗和预后的判断。

三、一张合格的免疫组化片是如何产生的？

病理技术员将当天HE常规片子移交给病理诊断医生后，医生将通过显微镜对其进行诊断，不能完全确诊的病例我们要做免疫组化来进行进一步诊断，病理医生开出免疫组化项目的医嘱，这时我们病理技术员将找出相应的刻有病人病理号的蜡块，找蜡块的过程我们也是三查三对，避免出现拿错蜡块的情况，将拿出的病理蜡块放在冰盒中，同时我们的另一位病理技术员将医嘱里面的免疫组化项目通过玻片打号机进行制片，玻片磨砂处将刻有医院名称，病理号，免疫组化项目，和二维码，制备好的免疫组化片子将由另一位技术员进行核对，避免相应病理号的免疫组化项目打错、漏掉。

准备工作完成后，这时我们将进行免疫组化切片，它不同于常规切片那样切一张片子，他是根据免疫组化项目多少进行连续切片厚度为3～5um，为了减少对蜡块的损耗，我们将通过切片机的微调进行调整，确保切片时减少损耗，（尤其是肿物比较少的蜡块），捞片也是有一定的要求，必须全部组织朝向一致，最后就是贴上我们的对照，将组织切片放入65℃的烤箱1小时，这一步是为了让蜡块中水分蒸发和石蜡融化，以确保组织切片能够牢固地贴附在玻片上。

脱蜡至水，使用二甲苯对切片进行脱蜡处理，然后经过递减浓度的乙醇二甲苯1：10min→二甲苯2：5min→二甲苯3：5min→无水乙醇1：5min→无水乙醇２：5min→95%乙醇5min→85%乙醇5min→75%乙醇5min，整个过程要避免干燥，干燥会导致非特异抗体结合，从而出现高背景染色。

抗原修复，常用PH9.0的Tris-EDTA和免疫组化片子一起放入高压锅，加热至沸腾，再继续加热2.5min，关闭电源，自然冷却，然后放入3%过氧化氢水溶液5min,灭活内源性过氧化物酶，PBS缓冲液洗涤切片，用免疫组化笔围绕组织画圈，加入相应的抗体，37℃1小时，用PBS缓冲液洗涤3次，加二抗37℃30分钟，PBS缓冲液洗涤3次，加入DAB进行显色反应，DAB工作液现用现配，密切观察切片显色程度和显色时间，一般为3～8min,及时用PBS缓冲液洗脱，防止显色过深，通过显微镜观察组织切片上的颜色变化，可以确定抗原在细胞或者组织中的位置和表达水平，在用苏木素进行核复染，1%盐酸酒精分化1s，自来水冲洗，返蓝5min,再经过酒精和二甲苯进行透明处理，最后封片，进行每日质控后移交给病理医生。

一张优质的免疫组化片为正确判断染色结果提供了良好的基础和前提，免疫组化染色准确地定位于正确的组织区域，免疫组化信号与背景之间应有明显的对比度，以便于识别和诊断，染色片应清晰，无明显的染色模糊或污染，染色背景干净，重复性高，即在不同时间或对不同样本进行相同的染色步骤时，结果应一致。